Господарсько-біологічна оцінка клонових підщеп груші в умовах західного лісостепу україни



Сторінка199/204
Дата конвертації05.02.2019
Розмір4,88 Mb.
1   ...   196   197   198   199   200   201   202   203   204
Постановка завдання. Метою нашого дослідження є ідентифікація промоторних і термінаторних елементів генетичних конструкцій в рослинах цукрових буряків за допомогою полімеразної ланцюгової реакції.

Виклад основного матеріалу. Як вихідний матеріал використовували рослини цукрових буряків, отримані в лабораторії селекції ІБКіЦБ НААН України внаслідок гетерозисної селекції. Трансформовані рослини, які були відібрані в польових умовах за фенотиповими ознаками, містять ген стійкості до гліфосату з невизначеною структурою генетичної конструкції. За літературним даними, будь- яка генетична конструкція повинна містити промоторну й термінаторну ділянки для роботи цільового гену [1; 5]. Для досліджень були відібрані вісім зразків, в тому числі один контрольний, який не містив трансгена.

Виділення ДНК проводили згідно з методикою, розробленою Дж. Дрейпером та ін. (1991 р.) [1]. Рослинний матеріал (по 500 мг кожного зразка) розтирали в охолодженій ступці. Лізис клітинних мембран здійснювали обробкою ЦТАБ різних концентрацій. Для видалення білків застосовували: хлороформ-ізоаміловий спирт у співвідношенні 24:1. Осадження та концентрування ДНК проводили, додаючи розчин (96%) етилового спирту. Отриманий осад розчиняли в 50 мкл ТЕ-буфера.

Для визначення генів промотора 35S мозаїки цвітної капусти та NOS термінатора використовували набори реактивів для детекції генетично модифікованих організмів методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) GenPac GMO-35S PCR test і GenPak GMO-NOS PCR test відповідно. Ампліфікацію ДНК проводили згідно з інструкцією за такою програмою: денатурація 95ºС – 60; відпал праймерів 58ºС – 40; елонгація – 74 ºС – 60, 45 циклів.

Продукти реакції ампліфікації розділяли електрофорезом в агарозному гелі 1,5% за напруги 150 В протягом 30 хв. з бромистим етидієм. Візуалізацію продуктів ампліфікації проводили під ультрафіолетовим світлом із довжиною хвилі 321 нм. За наявності специфічних фрагментів ампліфікації дійшли висновку про присутність ДНК генетично модифікованих компонентів у матеріалі, що аналізується.

На рис. 1 наведено приклад результатів електрофоретичного розподілу продуктів ампліфікації, отриманих з використанням праймерів до 35S промотора.




Поділіться з Вашими друзьями:
1   ...   196   197   198   199   200   201   202   203   204


База даних захищена авторським правом ©medicua.org 2019
звернутися до адміністрації

    Головна сторінка